d_kishkinev (d_kishkinev) wrote,
d_kishkinev
d_kishkinev

Последняя нобелевка по физиологии

Взято отсюда.

Мыши стали моделями

Нобелевская премия 2007 года по физиологии и медицине присуждена ученым из США — Марио Капеччи и Оливеру Смитису и Великобритании — Мартину Эвансу за открытие принципов внедрения специфических модификаций генов у мышей с помощью эмбриональных стволовых клеток. Проще говоря, этот метод позволяет «выключать» гены или вносить в них изменения, а в результате получать информацию, как это влияет на организм или на формирование генетических заболеваний. Модели заболеваний, созданные с применением этого метода, позволяют понять биохимию и физиологию наследственных патологий и помогают формированию принципиально новых подходов к их лечению.

Многие эксперты отмечают, что прорывные работы, связанные со стволовыми клетками, до сих пор не удостаивались высокого внимания и оценки. Нобелевский комитет, можно сказать, проявил смелость, большую, к примеру, чем правительства США и Великобритании, которые не захотели лет тридцать назад дать гранты на эти работы, сочтя их слишком амбициозными. Сейчас же эта технология, уже значительно усовершенствованная, приносит пользу как практической медицине, так и фундаментальным изысканиям на тему «как устроена жизнь».

«В отмеченной Нобелевским комитетом технологии слиты две идеи: одна о том, как лучше всего производить изменения в геноме с помощью эмбриональных стволовых клеток, вторая — как производить эти изменения в нужном месте генома», — рассказывает завлабораторией генетической инженерии клеток центра «Биоинженерия» РАН Егор Прохорчук.

В современной биологии эта технология сейчас известна как направленная инактивация, или «нокаут» генов. Установлено, что в организмах млекопитающих лишь несколько процентов генома — это гены, кодирующие белки. Многие функции белков уже изучены, но не все. Для того чтобы уяснить функции конкретных белков, ученые «нокаутируют» (выключают) отдельные гены. Кроме этого ген в ДНК можно заменить мутантным геном, чтобы понять механизмы генетических заболеваний и попытаться подобрать к «поломкам» ключи. Поскольку геномы мыши и человека содержат примерно одинаковое число генов, а сходство последовательностей составляет около 90%, мыши — отличные модельные животные. Еще одной причиной использования мышей является возможность изолировать их эмбриональные стволовые клетки, в которых любой ген можно подвергнуть модификации.

Мартин Эванс первым в мире «потрогал руками» мышиные эмбриональные стволовые клетки. Эванс выделил их в 1974 году. Произошло это почти случайно. Ученый работал с мышиными клетками карциномы. Он знал, что раковые клетки бессмертны, и хотел вывести чистую линию таких эмбриональных раковых клеток, которыми можно было бы манипулировать в культуре — что-то в них изменять, а затем контролировать и отбирать нужные. И в дальнейшем с помощью этих измененных клеток производить трансгенез — встраивать их в животных. До этого для трансгенеза использовалась технология, при которой нужный ген с помощью вектора вставлялся в оплодотворенную яйцеклетку, а затем модифицированная яйцеклетка встраивалась в суррогатную самку. Проблемы было две: первая — нужный ген встраивался совершенно случайно в разные места генома, и для того, чтобы получить животное с нужными признаками, было необходимо проделывать десятки тысяч опытов. Вторая проблема — модифицированную оплодотворенную яйцеклетку невозможно было контролировать, результаты можно было увидеть лишь после рождения потомства. Эта методика была малоэффективна и чудовищно дорога.

Эванс считал, что куда удобнее использовать для трансгенеза эмбриональные раковые клетки. «Он внедрял эти клетки в бластоцисту (начальная стадия плода) мыши. Потом эта бластоциста подсаживалась суррогатной самке, — рассказывает Егор Прохорчук. — Но эти исследования прервались, поскольку у мышей не образовывались сперматозоиды и они быстро умирали от множественных опухолей».

Казалось, идея провалилась. Однако по ходу этих опытов Эванс заметил, что в тех клетках, которые он извлекал из мышиных эмбрионов, были не только раковые, но и клетки без молекулярных раковых маркеров — при этом очень похожие по структуре и поведению на раковые. Он их выделил в самостоятельную культуру и провел опыты с ними. Это и были здоровые эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Опыты подсаживания в бластоцисту этих эмбриональных клеток позволили получить здоровое потомство. И Эванс понял, что именно эмбриональные стволовые клетки, а вовсе не раковые, могут стать очень удобным инструментом для получения модельных организмов с желаемыми генными изменениями. Тогда он встроил в ЭСК ретровирус в качестве маркера (сигнальной метки) и в конце вереницы опытов (см. схему) получил мышат с ретровирусами. Проверив, что методика работает, Эванс вставил в ЭСК мутантный ген одной из нейродегенеративных болезней и получил линию больных мышей.

Обладателями Нобелевской премии по физиологии и медицине стали (слева направо):англичанин Мартин Эванс и американцы Марио Капеччи и Оливер Смитис за технологию направленного изменения генома мышей :: Фото: AP

Обладателями Нобелевской премии по физиологии и медицине стали (слева направо): англичанин Мартин Эванс и американцы Марио Капеччи и Оливер Смитис за технологию направленного изменения генома мышей :: Фото: AP

Француз Альбер Ферт (слева) и немец Петер Грюнберг (в центре) объявлены лауреатами Нобелевской премии по физике. Главным химиком Шведской академией наук назван Герхард Эртль :: Фото: AP

Но в этих манипуляциях внедряемый ген встраивался случайным образом. Нужно было придумать, как мутантный ген вставить точно в то место, где сидит его здоровый «собрат».

К этому времени (конец восьмидесятых) как раз подоспели работы Марио Капеччи и Оливера Смитиса. Они также, независимо друг от друга, искали способ направленного изменения генома и разработали метод так называемой гомологичной рекомбинации. Сначала оба начинали работать со взрослыми соматическими клетками, в ядро которых встраивали конструкцию (вектор) с нужным геном, к примеру, устойчивости к антибиотику. Этот ген должен был «выбить» или нокаутировать ген из клеточной ДНК. Для этого придумывалась специальная конструкция, которая должна была найти нужное место с помощью последовательностей, идентичных (или гомологичных) окружению гена — кандидата на выбивание. «Эти последовательности мы называем “плечами”, — говорит Прохорчук. — Когда вектор встраивается в нужное место, происходит так называемая гомологичная рекомбинация, в результате которой ген устойчивости к антибиотику из вектора меняется местами с геном-жертвой. При этом ген-жертва из ДНК выбрасывается. Если же вектор встраивается в постороннее место, такая рекомбинация не происходит». Далее отбирались клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация, но для этого нужно было проверить тысячи, а то и десятки тысяч клеток. Заковыка была в том, что в процессе гомологичной рекомбинации участвует множество «помощников», которые сначала перекручивают участки вектора с клеточной ДНК, потом их разрезают и склеивают. Во взрослых соматических клетках эта бригада помощников работает крайне вяло. Когда ученые попробовали те же опыты с раковыми клетками, получилось лучше. Ну а с эмбриональными стволовыми — еще лучше. Там «помощники» очень активны.

Таким образом соединились две технологии — культивирования ЭСК, которые можно модифицировать, разработанная Эвансом, и гомологичной рекомбинации от Капеччи и Смитиса. По словам Капеччи, новая технология в десятки тысяч раз удешевила создание организмов с направленными мутациями. В мире уже выведено более 500 линий — моделей многих человеческих заболеваний: сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, онкологических, а также диабета, на базе которых отрабатываются новые фармпрепараты.



Для меня эти исследования интересны и с практической точки зрения. Речь идет о том, чтобы создать нокаутные линии птиц (например, кур или зебровых амадин, как самых популярных в  лабораторных исследованиях) по белкам криптохромам. Эти белки "подозревают" в том, что они играют ключевую роль в восприятии магнитного поля у птиц. Если бы нокаутные по криптохрому птицы не могли выполнять тесты по распознаванию направления с помощью магнитного поля, то это было бы весомым подкреплением "криптохромной" гипотезы магнитного компаса, которая сейчас столь популярна у исследователей. 

О криптохромах и магниторецепции можно почитать в моей обзоре здесь (извините за тяжелый pdf).
Tags: science
Subscribe

  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

    When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
    You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.
  • 0 comments